Projets des étudiants en Master 2

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Projets des étudiants en Master 2

Florian Bouchet-Crivat

L’’hépatocarcinome sur foie sain dans  la porphyrie hépatique aigüe : un modèle paradigmatique pour l’étude des aspects moléculaires et cellulaires

 

Projet de recherche

Porphyrie aigüe intermittente (PAI)

Les porphyries sont un ensemble de maladies métaboliques héréditaires associées à une anomalie de la voie de biosynthèse de l’hème.

 

La PAI est une maladie héréditaire autosomique dominante, elle est la plus fréquente (mutations dans le gène de la troisième enzyme de la biosynthèse, l’hydroxymethylbilane synthase (HMBS)). HMBS est une des trois enzymes limitantes de la voie de biosynthèse de l’hème dans le foie. Dans la forme classique de PAI, l’activité HMBS est usuellement diminuée à approximativement 50 % dans tous les tissus, niveau entraînant  l’expression  de manifestations pathologiques en présence de facteurs co-précipitants comme l’administration de médicaments porphyrogéniques, l’inflammation, le jeûne.

La crise aiguë est caractérisée par des symptômes neuroviscéraux, comme la douleur abdominale,  des nausées, des vomissements, la neuropathie sensorielle et motrice et des symptômes neuropsychiatriques. La crise aiguë peut être mortelle en raison des effets neurotoxiques des précurseurs de l’hème.

En dehors de la crise aiguë, la PAI est associée à des  comorbidités plus fréquemment  retrouvées chez les patients présentant une élévation chronique des précurseurs (porphobilinogène PBG et acide amino levulinique ALA) et/ou des crises aiguës récurrentes.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est une des complications majeures observées chez les patients PAI (Andant et al, 1998). Ce cancer, de mauvais pronostic, est la plus fréquente des tumeurs hépatiques primaires.

 

CHC et PAI
Les principaux facteurs de risque connus pour le CHC sont viraux (hépatite B et C), toxiques (alcool et aflatoxine), métaboliques (diabète, hémochromatose, stéato-hépatite..) et immunitaires (hépatite auto-immunitaire et cirrhose biliaire primitive).
La première association  entre PAI et CHC a été faite en 1984 (Lithner and Wetterberg, 1984), en Suède, où, en raison d’un effet de fondateur, la fréquence de la maladie est une des plus élevée dans le monde. La fréquence des CHC chez les patients PAI varie selon l’origine ethnique et la mutation associée (Hardell et al, 1984, Andant et al, 1998). Le risque de CHC peut être multiplié par 64 à 100 fois dans les populations PAI par rapport à la population générale (Karim et al, 2015).

Une des particularités du CHC dans la PAI est qu’il se développe le plus souvent sans cirrhose, fibrose ou nécrose préexistante, en l’absence d’autre facteur favorisant (alcool, hépatite virale ; Deybach and Puy, 2011).

 

La physiopathologie de la maladie est imparfaitement comprise, mais les hypothèses incluent :
1. Une accumulation de radicaux libres en raison d’un déficit en enzymes anti-oxydantes contenant de l’hème dans les  hépatocytes;
2. Les effets direct de mutations de HMBS sur la transcription de gènes suppresseurs de tumeur (Schneider-Yin et al, 2014);
3. Le déficit en hème ;

  1. La surcharge hépatique en Fer ; une surcharge en fer est fréquemment observée chez les patients porphyriques (Baddams et al, 2014) en particulier chez les patients PAI présentant des attaques récurrentes (Données du CFP).

 

II Méthodes

II-1 Modèle cellulaire

La lignée HuH7 dérive d’une patiente atteinte d’hépatocarcinome. Entre nos mains, ces cellules hépatocytaires, considérée comme assez différenciées, sont capables d’accumuler des porphyrines tout en exprimant une gamme large du métabolisme des enzymes impliquées dans la physiopathologie de la PAI (ALA Synthase1, Hème Oxygénase 1, HMBS).

 

Le déficit en HMBS sera reproduit utilisant une stratégie shRNA. Brièvement, le shRNA dirigé contre HMBS sera transfecté dans des cellules afin d’obtenir moins de 50 % d’expression HMBS. Différents ShRNA seront testés seuls ou en combinaison pour produire différents niveaux d’inhibition d’HMBS, après sélection  grâce à un antibiotique et séparation clonale. Le niveau d’expression dans chaque clone d’AIP-HUH7 sera mesuré au niveau transcriptionel (RTqPCR) et au niveau traductionel et post-traductionel (Western blot des lysats cellulaires et des surnageants et mesure d’activité HMBS dans les surnageants de culture). Les clones identifiés comme présentant un  déficit d’expression seront testés pour l’induction ALAS1 en réponse aux médicaments porphyrogéniques (Phenobarbital, Rifampicine) et à la N-méthyl porphyrine (un inhibiteur de ferrochelatase).

Cette méthode de sélection graduelle devrait nous permettre d’identifier des clones PAI-HUH7 avec des niveaux d’induction ALAS1 variable, mimant la variabilité phénotypique de la PAI. Les clones seront exposés à de fortes concentrations d’ALA exogène pour induire la surexpression d’ALAS1 et les mécanismes cellulaires correspondants.

L’apoptose sera recherchée par cytométrie en flux (Annexine V),  ainsi que le fonctionnement mitochondrial (Mitotracker).

La génotoxicité sera étudiée par recherche de micronoyaux, électrophorèse de l’ADN et CGH array. Le stress oxydatif sera étudié au niveau de transcriptomique et protéique (Cytokines, Protéines de l’Inflammation, Glutathion, Myléoperoxydase, 8-isoprostane …). Les résultats attendus sont la caractérisation de plusieurs lignées pouvant servir d’outil dans l’exploration de la physiopathologie du CHC chez les patients PAI, en terme d’expression d’enzymes de la voie de biosynthèse de l’hème et d’acteurs du stress oxydant, tout en ébauchant l’étude de l’impact de l’exposition à des doses importantes d’ALA sur ces cellules.

III Faisabilité et Impact Attendus sur la recherche future dans le domaine
La faisabilité du projet est excellente, puisque la plupart des outils sont déjà disponibles dans l’équipe ou sur la plate-forme Louis Mourier CFP.

Ce travail pourrait mener à la découverte de nouveaux acteurs moléculaires dans le développement de CHC sur le foie sain. En fonction des résultats obtenus, ce projet pourrait permettre d’obtenir les résultats préliminaires nécessaires à la soumission d’une demande de financement à l’ANR, qui pourrait permettre par d’autres modèles d’évaluer également l’impact direct des mutations dans des lignées CRISPR-Cas9.

L’association dans le cadre de ce projet  du DHU Unity, du CFP et de l’INSERM permettra en fonction des résultats obtenus de transférer la découverte moléculaire vers la pratique quotidienne.

Meredith Flacs

Résumé DHU – Meredith FLACS- Projet de Master 2 : MALADIE DE CROHN ANOPÉRINÉALE :  MISE AU POINT D’UN MODÈLE EXPÉRIMENTAL DE LÉSIONS ANOPÉRINÉALES PRIMAIRES ET SECONDAIRES – ULCÉRATIONS, ABCÈS, FISTULES – CHEZ LE PETIT ANIMAL. 

Synthèse :

  • Lésions anopérinéales de la maladie de Crohn : épidémiologie et histoire naturelle ; thérapeutiques et problématique actuelle

La maladie de Crohn (MC), Maladie Inflammatoire Chronique de l’Intestin (MICI), constitue une entité clinique hétérogène, dont  les localisations inflammatoires principales sont l’intestin grêle, le colon, l’anus et le périnée.   Les  lésions anopérinéales (LAP) au cours de la Maladie de Crohn (LAPMC) sont fréquentes, avec une incidence variant de 3,8 à 80% selon les séries ; 1 malade sur 2 présentera une lésion anopérinéale, au cours de l’évolution de sa maladie, notamment en cas d’atteinte digestive distale.  La localisation périnéale peut être inaugurale ou précéder les manifestations intestinales (30%). Dans près de deux tiers des cas, on note l’apparition de telles lésions dans les 10 ans qui suivent le diagnostic.  Elles sont favorisées par les poussées inflammatoires luminales et représentées par les abcès et les fistules, simples ou complexes. Enfin, les sténoses ano-rectales sont classées parmi les lésions secondaires mécaniques, cicatricielles.  Les LAP secondaires de la MC ont un impact important sur la qualité de vie des patients.  Elles  sont la source d’une symptomatologie douloureuse, très invalidante, sont souvent récidivantes et nécessitent le recours à la chirurgie dans la majorité des cas. Les recommandations actuelles imposent en effet le plus souvent une chirurgie en urgence, non délétère pour l’appareil sphinctérien, associé à une antibiothérapie.  La technique chirurgicale de référence consiste à évacuer la cavité abcédée et drainer le trajet fistuleux par un séton non serré, sous anesthésie générale. Après drainage chirurgical efficace, des traitements ayant pour objectif la fermeture des trajets fistuleux (Plug, encollage, lambeau d’avancement muqueux rectal etc.) peuvent être discutés.  Ces traitements chirurgicaux sont d’autant plus efficaces qu’ils sont réalisés sur une maladie quiescente ou contrôlée par les traitements immunosuppresseurs tels que l’Azathioprine et les anti-TNF alpha, dont le but est d’obtenir une cicatrisation muqueuse (« mucosal healing »).  Toutefois, la récidive demeure fréquente à moyen terme (de l’ordre de 50%). A long terme, le patient est exposé, en cas de destruction du sphincter anal, d’atteinte rectale sévère associée et d’incontinence, aux traitements chirurgicaux digestifs radicaux, lourds, soulignant le caractère invalidant de la maladie.   En effet, la gravité des LAP de MC tient principalement aux risques évolutifs à long terme :

 – De  destruction de l’appareil sphinctérien anal 

– D’amputation abdominopérinéale avec stomie définitive qui en découle.  

 

                – Objectif

Malgré l’arsenal thérapeutique médico-chirurgical développé depuis les deux dernières décennies, une chirurgie radicale concerne encore près de 40% des patients atteints de lésions anopérinéales.  Un des objectifs de recherche actuellement conduit au laboratoire, est l’élaboration de nouveaux biomatériaux actifs, couplés aux immunosuppresseurs, pour optimiser la cicatrisation des lésions anopérinéales inflammatoires chroniques. Une partie de ce projet nécessite l’établissement d’un modèle animal spécifique développant des LAP, sur fond d’inflammation colorectale –Crohn-like.

L’objectif de notre travail est donc de développer un modèle expérimental chez le petit animal, spécifiquement chez le rat, de fistule anale trans-sphinctérienne, sur fond d’inflammation colorectale. Pour ce faire, la confection d’un trajet fistuleux anopérinéal portera, au cours d’une étude pilote visant à mettre au point un modèle optimal, sur 10 rats non transgéniques, via l’introduction d’un fil serti au travers de la paroi rectale et ressortant par un orifice externe périnéal situé à 9h en position de la taille. L’inflammation colorectale sous-jacente sera induite par lavements de TNBS- -2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, inducteur de colite murine. Les critères de jugement employés pour confirmer la présence d’un trajet fistuleux seront cliniques, morphologiques (IRM) et histologiques . Nous estimons un délai nécessaire de 7 à 14 jours pour la constitution de cette fistule.

  • Résultats attendus :

 

Mise au point d’un modèle de fistule anale trans-sphinctérienne chez le rat, fiable, reproductible, validée morphologiquement à l’aide de l’IRM-petit animal et histologiquement, sur fond d’inflammation colorectale induite.

A terme, nous espérons une fistule pérenne afin d’entreprendre l’évaluation pré-clinique du  biomatériau actif actuellement en cours d’élaboration.

Damien Soudan

Résumé grand public Français DHU.

 

Titre du projet :

 

Mise au point d’un hydrogel actif comme traitement de la rectite chronique inflammatoire : évaluation dans des modèles animaux de colites.

 

Etudiant :  Damien SOUDAN

 

Equipe : Inserm 1149 «  Centre de Recherche sur l’Inflammation » Equipe Eric Ogier-Denis Jean Pierre Hugot.

 

Synthèse :

L’atteinte rectale des maladies inflammatoires chroniques intestinales (MICI), et particulièrement la rectite isolée de rectocolite hémorragique (RCH), a une prévalence de 44 à 60% . Dix pourcent des rectites pures sont réfractaires aux thérapeutiques usuelles. En pratique courante, des immunomodulateurs sont utilisés par voie systémique (intraveineuse ou sous cutanée) pour les rectites réfractaires avec une efficacité histologique mal connue et des effets secondaires inhérents à leur utilisation. Bien que complexe et multifactorielle, la physiopathologie l’inflammation muqueuse de la RCH est la résultante d’une interaction trop étroite entre le microbiote (ensemble des bactéries de la lumière intestinale) et les cellules épithéliales. Il est démontré que cette étroite interaction est la conséquence d’une altération de la barrière de mucus (sécrétion de mucines imperméable aux bactéries tapissant la muqueuse). Dans la RCH, la sécrétion de mucus est altérée quantitativement et qualitativement. En situation physiologique, la barrière de mucus est composée de mucines (protéine hautement glycosylée). La synthèse ex vivo de mucines est techniquement et financièrement très complexe.

L’objectif de notre travail est d’évaluer différents polymères de sucres employés comme mucus de synthèse et vecteurs d’effecteurs pharmacologiques directement sur la muqueuse lésée. Parmi les molécules, connues et d’utilisation médicale reconnue, le dextrane, le pullulane et l’acide hyaluronique seront évalués. L’acide hyaluronique, glycosaminoglycanne (GAG) composant de la matrice extracellulaire, est un élément essentiel à la structuration tissulaire. Il permet la création d’espace facilitant la migration cellulaire et la synthèse tissulaire et s’opposerait au processus fibrotique (destruction tissulaire). Les GAG exercent des effets protecteurs anti-inflammatoires en inhibant l’activité ou la synthèse de certaines protéases et en limitant le passage des cellules inflammatoires à travers l’endothélium. Le dextrane et le pullulane sont deux polymères saccharides, peu couteux dont les capacités à former un hydrogel imperméable sont reconnues et déjà utilisées dans d’autres applications médicales .Utilisé sous forme de gel, de membrane ou d’éponge, ces molécules constituent des biomatériaux de choix pour l’ingénierie tissulaire ou la délivrance d’effecteurs pharmacologiques. Cette approche thérapeutique comblerait un manque dans l’arsenal thérapeutique actuel, avec un risque réduit d’effets secondaires.

Notre étude portera sur le traitement de souris, chez lesquelles une rectite sera induite par instillations rectales d’acide trinitrobenzène sulfonique (TNBS). Notre travail se fera en deux étapes, la première concernant la sélection du meilleur composé en l’évaluant seul comme traitement d’une colite. Ces polymères seront instillés par lavements successifs. Les lavements seront réalisés quotidiennement pendant 5 jours (J1-J5). L’efficacité thérapeutique sera évaluée par une notation histologique réalisée en aveugle par une pathologiste spécialisée dans le tube digestif. Une fois le polymère sélectionné nous évaluerons et comparerons son efficacité après couplage à un agent immunomodulateur. L’activité histologique sera l’un de nos critères principaux de jugement, L’activité inflammatoire sera évaluée en étudiant les cellules et les molécules inflammatoires dans la muqueuse. La pharmacocinétique du produit sera également évaluée grâce au couplage de l’hydrogel à un produit de contraste visible à l’IRM (gadolinium) et évalué par IRM itératives (compétences acquises au laboratoire). L’absorption de ce traitement, sera évaluée en testant différentes concentrations d’anti-TNF en lavement sur plusieurs sous-groupes de souris, et en évaluant leurs concentrations sériques pour en apprécier le passage systémique.

Enfin la tolérance sera également un critère d’analyse majeur.

 

Résultat attendu

 

Mise au point d’un nouveau traitement des rectites inflammatoires, dans le but de soulager les patients d’une maladie ayant un impact péjoratif fort sur leur qualité de vie.